EP12-A2标准解读：定性体外诊断产品偏差及不精确度研究方法
对于一款定性的体外诊断产品，制造商应该如何描述其测试性能和帮助客户设计测试性能验证研究呢？为了能更好的对用户评估定性诊断产品性能测试的方案设计和数据分析提供一致的方法，我们可以参考CLSI EP12标准（定性测试性能评价用户协议），来进行精密度和方法对比的研究。
下面，小编将给大家梳理EP12标准中的大纲及重点描述如何进行偏差及不精确度研究的相关内容，希望能够对大家有一定的帮助。关于对比方法和数据分析的研究内容，小编将下次再进行详细地分享。
1. EP12大纲
2. EP12重点内容解读
EP12主要包含定性测试的临床应用，设备的熟悉及培训，评估材料、偏差和不精确度研究、方法比较，数据分析这六个章节。
本文中小编将详细讲述前四个章节相关重点内容（红色标识内容）。
2.1 临床应用
众所周知，定性试验可用于广泛的临床目的。它们的用途可以被描述为筛查、诊断、确认或监测。该检验的灵敏度和特异性、预测值以及该疾病或病情在被检验人群中的流行率决定了该定性检验的临床效用。
对于定性试验根据其预期使用情况一般可以分为以下三种：
1）筛选试验 Screening tests
临床上，筛选方法用于测试人群亚群是否存在分析物。例如VDRL梅毒血清学试验。这些用于筛选目的的定性测试应具有较高的灵敏度，以确保检测到真阳性结果。一般来说，筛选试验比诊断性或验证性试验产生更多的假阳性结果。如果存在良好的验证性测试，并且如果假阳性结果的社会/经济后果不太严重，则可以容忍这种较低的特异性。
需要对阳性筛查结果进行验证性检测，检测出现假阳性结果可能比出现假阴性检测结果更好，因为假阴性可能会产生更严重的后果，如感染性血液输血，或未能及时治疗严重却可治疗的疾病。
2）诊断试验 Diagnostic tests
定性测试通常用于诊断一个特定的疾病或条件，基于临床怀疑它可能存在。临床上，对适当的治疗要求诊断试验具有良好的灵敏度和特异性。如果在诊断试验之后进行了验证试验，则特异性要求可能会稍低一些。
3）验证试验 Confirmatory tests
验证性试验用于对筛查或诊断试验结果的验证或确认。对检测结果的验证或确认可以帮助临床医生来确定临床诊断。验证性 试验的设计具有较高特异性（如有必要，则以牺牲灵敏度为代价），并具有较高的阳性预测值（PPV）。例如:在筛查试验(VDRL梅毒血清学试验)后需进行验证性试验（荧光密螺旋体抗体吸收（FTA-ABS）梅毒血清学试验）。
2.2 设备的熟悉和培训
1）目的
2）持续时间
在培训课程中，每个操作者都应该演示和实践该方法，并且需要另选一天对每个操作员熟练程度进行考核。在对候选方法进行评估与考核之前，应客观判断所有操作人员在培训期间都合格了。
2.3 评估材料
1）质控
需要适当的QC材料来确保候选方法的性能一致。应按照指示使用制造商提供的质控品。如果能保证质控品没有基质效应，则可以使用其他稳定的商业质控品或临床质控品。如果条件允许，在进行多种方法比较时，所有测试方法应使用相同的质控品。对于许多定性测试，每天使用阴性和阳性对照就足够了，而有一些定性测试可能需要更频繁地进行对照测试。
接近Cut-off值的阳性和阴性质控品比那些非常高或非常低的质控品可以检测到更多的错误。但是，如果质控品的值为Cut-off或非常接近Cut-off值，那么即使测试没有显著的错误，也可能不能运行。
2）样本的收集与处理
用于评估的临床标本必须根据制造商的说明书和良好的临床实验室实践来收集。如果某种测试需要立即采集和检测新鲜标本，以减少对标本质量的担忧。那么如果运输系统代表典型的标本收集和处理，使用运输系统对评估样品进行处理可能是合适的。对于某些临床情况，采集样本的时间是至关重要的并且在评估期间应保持一致。
2.4 偏差和不精确性研究
定性测试应同时考虑偏差（系统差异）和不精确性（随机变异）。
定性测试的Cut-off值是由制造商建立，超过该Cut-off值时结果报告为阳性，低于该Cut-off值时结果报告为阴性。定性测试的精密度研究由在Cut-off值附近分析物浓度下的不精确度来建立，用低阴性或高阳性样本来测量定性分析的不精确性是不合适的。
对于不同的候选方法，影响Cut-off值附近精密度的可变性因素将是不同的。其中一些来源可能包括不同的样品或候选方法的运输或储存条件、不同的操作人员、不同的环境温度或光照条件、批次之间的可变性、不同的设置、孵育或干燥或读取时间等。那些设计方案时应熟悉所考虑的方法中可变性的潜在来源，并在必要时将这些规定的条件纳入其方案。
1）Cutoff值附近的分析物浓度
制造商根据试验的预期用途和预期的临床灵敏度和特异性来确定他们的测试Cut-off值。一旦制造商建立了这个Cut-off值，用户通常就无法改变它。低于Cut-off值的结果将为负值，高于Cut-off值的结果将为正值。
在完美的条件下，如果用户对一个Cut-off浓度的样本进行一系列重复测试，其中50%的测试是阴性的，50%是阳性的。由于完美情况很难实现，每个实验室将使用一个接近Cut-off值的略有不同的分析物浓度，这个是对应测试结果50/50比例情况发生改变的分析物浓度。在EP12中将每个实验室略有不同的分析物浓度定义为C50。在被测试的样本中，分析物浓度高于C50 (或浓度低于C50)，则重复结果均为阳性（或阴性）的概率就越大。
在理想的情况下，当对一个被分析物水平恰好在Cut-off浓度的样品进行重复性研究时，C50将完全等于制造商建立的Cut-off值。在Cut-off值处的可重复性研究中，定性测试中的偏差将与制造商指定的Cut-off值和评估研究中C50之间可能存在的差异有关。
下面的图1是“不精确曲线”的图形描述，显示了一系列结果（在规定条件下进行的测试）的阳性和阴性结果的百分比如何随着C50附近实际分析物浓度而变化的函数.请注意，增加分析物的浓度（将浓度向右移动）预计将产生相应较大的阳性结果百分比，以及较小的阴性结果百分比。同样地，降低浓度（向左移动浓度）预计将产生相应的较小的阳性结果百分比和较大的阴性结果百分比。对于不同的候选方法、在不同的实验室进行分析，图1所示的不精确曲线的实际形状和陡度将有所不同。
对定性检验的不精确曲线的描述需要明白的是：由于不精确度，对同一样品浓度的多次观察不会产生完全一致的检验结果（即正或负、正或负、无或存在）。
图1
还有不同的方法来描述分析物浓度接近C50 的样品重复结果的不一致性（不精确性）。类似于CLSI对C50的定义，实验室将会给定浓度C5和95，这将分别产生5%和95%的阳性结果。5和C95可以提供来自给定方法的重复结果不一致性的信息。对浓度为<C5的样品进行重复的结果始终为阴性，对于浓度为>C95的样品，进行重复的结果始终为阳性。这些结果出现真阳或真阴的概率是取决于候选方法的诊断准确性。
浓度的范围在C5和C95的方法被称为“95%区间”。然而，这个术语有时会与95%的置信区间相混淆。因此，CLSI提出了一个新的术语“C5-C95区间”表示为(C5-C95)来表示“浓度的范围C5到C95”。字母“C”表示浓度，下标（5、50或95）表示阳性结果的百分比。
在C5-C95区间外的分析物浓度（＜C5和＞C95)，候选方法在对同一样本的重复测试中始终产生相同的结果。C5-C95区间（≥C5和≤C95)以及对同一分析物的试验结果在不同测试中可能是不同的，而区分这种差异的能力可以作为评估定性诊断测试的有用工具。C5-C95区间宽度提供了关于定性测试的精密度的信息，因为它反映了重复结果不一致的浓度范围。
图2 不同的不精密度曲线的例子
上图2显示了两种候选方法的不精度曲线。方法1（实橘红线）在C50附近比方法2更精确。两种方法的C50浓度相同，因此两者之间没有系统差异。在方法1中，曲线在C50附近非常陡峭，因此仅在任何一个方向上移动一个小的浓度增量就会产生几乎所有的正的或负的结果。对于方法2（蓝色虚线），曲线在C50附近不那么陡峭，所以移动相同的小浓度增量将产生更多的正结果和负结果的混合物。需要更大的浓度增量才能达到结果与方法1一样一致的正或负的点。这反映在方法2的C5-C95区间宽度大于方法1的C5-C95区间宽度上。
2）阴性和阳性质控
在评估过程中，对照材料（质控品）应进行每次测试，以证明分析符合预期的性能要求，数据才会被认为是有效的。在方法研究的比较过程中，在候选方法的每次运行过程中，都要测试制造商推荐的阴性和阳性质控品。如果方法的比较研究是在10天内完成，每个对照组将重复10次。如果方法研究的比较完成超过20天，每个对照将总共有20个重复。
3）分析物浓度在C50附近的定性方法-精密度试验
理想情况下，实验室希望知道候选方法在其规定条件下的整个不精确度曲线。然而，评估这整条曲线的实验超出了EP12的范围。为此设定允许实验室确定是否有一个特定的浓度范围，例如，±为20%的C50（指定为−20%到+20%的浓度范围），包含C5-C95区间。如果−20%到+20%的浓度范围包含了C5-C95区间，那么样本浓度和C50相差±20%或更多时可以期望产生一致的结果。即，来自C5-C95之外的样本的结果可以被认为是精确的。因为如果大于C95，它们将始终产生阳性结果，或者如果小于C5，则始终产生阴性结果。这里选择± 20%仅用于说明目的。例如，用户还可以根据预期的用途和可接受的精度，选择±的10%或±的30%的比例。
4）试验过程
候选方法的说明书可能会声明分析物的Cut-off值，但有时它没有。如果提供了Cut-off值，那么它可以作为下面的实验中代替C50的近似值。如果不提供Cut-off值，则可以从阳性样品中进行系列稀释，并可以重复测试稀释样本，以估计将产生50%阳性和50%阴性结果的浓度。
步骤1
准备三个样品。
首先，制备一个浓度为C50的样品。然后，再准备两个样品，样品的浓度分别高于C50的20%和低于20%。这些样品应准备有足够的体积，以允许对同一样品进行多达40次或更多的重复测试。
步骤2
对3个样本重复检测40个，并确定每个样本的阳性和阴性结果的百分比。
Note：如果不能对每个样本进行40次测试，则可以从较少的重复中获得有用的信息，但这种结果的统计能力较小。
步骤3
使用从步骤2中得出的百分比来确定以下两个大内容。
内容1：准备好的C50是否正确?
答案取决于所观察到的结果。两种可能的结果类型和相应的结论是：
第一种：如果在制备的C50的40个重复测试中有13个或更少（32.5%）为阳性，或者在40个重复中有27个或以上（67.5%）为阳性，结论是制备的C50是错误的（不是C50）。显著性水平α为5%不成立。
第二种：如果在制备的C50的40个重复测试中有14到26个（从35%到65%）为阳性，那么你就可以得出结论，制备好的C50是可信的。这一结论的可信度取决于观察到的实际结果和测试的样本数量。
在实际操作中，一个实验室可能很难准确地估计其C50。为了说明，如果在制备的C50上的20个（50%）重复中有10个为阳性，则双侧95%置信区间将表明阳性结果的真实百分比可能在30%到70%之间。因此，该浓度的样品的阳性结果的真实百分比可以低至30%，高达70%，制备的样品的实际浓度可以在C30到C70的任何地方。如果40个重复中有20个（50%）是阳性的，那么双侧95%置信区间将表明阳性结果的真实百分比可能在35%到65%之间。如果100个重复中有50个（50%）是阳性的，那么双侧95%置信区间将表明阳性结果的真实百分比可能在40%到60%之间。
内容2：−20%到+20%的浓度范围是否包含候选方法的C5-C95区间?
答案再次取决于观察到的结果。有四种不同的结果类型，每一种都有不同的结论。
第一种：如果在+20%样品浓度下观察到35/40（87.5%）阳性结果，在−20%样品浓度下观察到35/40（87.5%）阴性结果，则用户可以得出结论：−20%至+20%浓度范围在C5-C95区间内。也就是说，C5-C95区间距离C50超过20%，该候选方法距离C50超过20%的样本不一定能产生一致的结果。α为5%不成立，并且真正的−20%到+20%的浓度范围不在C5-C95区间内。为了确定C5-C95区间是否在更宽的浓度范围内，需要使用和C50浓度差异更大的样品进行另一个实验，例如±30%。
第二种：如果在+20%样品浓度下观察到36/40（90%）以上阳性结果，在−20%样品浓度下观察到36/40（90%）以上阴性结果，则数据与+20%至−20%浓度范围包含了C5-C95区间并不矛盾。距离C50浓度相差20%以上的样品可以用该方法得到一致的结果。
第三种：如果在+20%样品浓度下观察到36/40（90%）或以上阳性结果，在−20%样品浓度下观察到35/40（87.5%）或以下阴性结果，则用户可以得出−20%至+20%浓度范围仅部分在C5-C95区间内。+20%浓度的样品距离C50比C95更远（+20%浓度的样品包含C5-C95区间），而−20%浓度的样品比C5更接近C50（−20%浓度的样品在C5-C95区间内）。需要使用更低于C50浓度的样品进行另一个实验，例如−30%。
第四种：如果在+20%样品浓度下观察到35/40（87.5%）阳性结果，在−20%样品浓度下观察到36/40（90%）阴性结果，则用户可以得出−20%至+20%浓度范围仅部分在C5-C95区间内。+20%浓度样品比C95更接近C50（+20%样品在C5-C95区间内），而-20%浓度样品距离C50比C5更远（−20%样品包含C5-C95区间）。这一结论的可信度取决于观察到的实际结果和测试的样本数量。需要使用更高于C50浓度的样品进行另一个实验，例如+30%。
需要注意的是，如果制备的C50不正确，那么−20%到+20%的浓度范围将会改变，这可能只导致该浓度范围的一端在C5-C95区间之外。
3. 结语
以上是对EP12-A2:定性测试性能评价用户协议中定性测试的临床应用及如何进行偏差和不精确度研究的解读，通过这篇文章，相信大家对如何利用C5、C50、C95进行偏差及不精确度分析有了基本认知。对于企业而言，即便不能通过参考EP12来建立测试性能特性，但还是可以使用在文章中描述的数据分析原则。
关于EP12中对比方法和数据分析的研究内容，小编将下次再进行分享。
